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【預(yù)期用途】
本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測的試劑盒。
【檢驗原理】
本試劑盒即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，引物經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高，分析靈敏度可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)，提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品，特異性高，引物是根據(jù)指標(biāo)高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的染料法熒光定量 PCR 反應(yīng)，既可用于定性，也可用于定量。用于定量時線性范圍至少5個數(shù)量級。
【試劑組成】
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名 稱 |
規(guī) 格 |
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2×SYBR qPCR MasterMix |
0.5mL×1管 |
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熒光 PCR 專用模板稀釋液 |
1mL×1 管 |
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超純水 |
1mL×1 管 |
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染料法qPCR 引物混合液 |
100μL×1 管 |
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qPCR 陽性對照(1×10E7 拷貝/μL) |
50μL ×1 管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【運(yùn)輸及保存】
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】
樣品 DNA。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【使用方法】
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
3. 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
2.1如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 第 6 步所得的第 4 號稀釋液（1×10E4 拷貝/μL）再加上一定量的水使總體積跟核酸純化試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
2.2 核酸提取：核酸提取可以采用上海撫生實業(yè)有限公司的核酸提取或純化試劑，操作方法按照說明書進(jìn)行。
3.染料法 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
3.1如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
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成分 |
樣品管 N+2 個 |
PCR 陰性 對照管 |
標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（1-6 管） |
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2×SYBR qPCR MasterMix |
10μL |
10μL |
各10μL |
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染料法qPCR 引物混合液 |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2 個待測 DNA 模板 |
8μL |
- |
- |
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超純水 |
- |
8μL |
- |
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第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6 號） |
- |
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各 8μL（2 號樣到2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
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過程
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溫度
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時間
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預(yù)變性 |
95℃ |
5 分 |
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PCR反應(yīng) （35個循環(huán)） |
95℃ |
10 秒 |
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60℃ |
40 秒（采集 SYBR 通道的熒光信號） |
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溶解曲線分析 |
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按 qPCR 儀器手冊執(zhí)行 |
注意：循環(huán)次數(shù)不要超過 35 個循環(huán)。
【結(jié)果判定】
【注意事項】
1．PCR 操作各階段應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作，避免交叉污染。
2．各組分不得與其他產(chǎn)品或不同批號的相應(yīng)成分進(jìn)行互換。
3．待測標(biāo)本若不及時檢測，應(yīng)保存于-20℃或-70℃。
4．樣品的處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作。
5．PCR 操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗和受過專業(yè)培訓(xùn)。
6．本試劑盒僅用于科研使用，不做為臨床診斷使用。
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人皰疹病毒5型(human herpesvirus5，HHV-5) 原人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV)病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
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資料/datasheet
